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La romanizzazione del territorio del Parco segue le sorti della conquista dell'Etruria meridionale. Nel 294 a.C. cade Roselle seguita nel 280 da Vulci e Volsinii. Fra il III e il II sec. a.C. viene completata la viabilità costiera con la costruzione dell'Aurelia di cui oggi rimangono solo alcuni frammenti come i resti di un ponte sull'Ombrone (Ponte del Diavolo) presso Spolverino, visibili durante l'escursione in canoa. Talamone, situata in una zona di confine tra culture diverse, poiché considerata "santuario" continua a mostrare elementi di compresenza romana ed etrusca e di continuazione della civiltà etrusca stessa (Frontone di Talamone del 150-130 a.C., oggi conservato ad Orbetello). Alcuni reperti archeologici come i vasi iberici rinvenuti a Colle Raso sui Monti dell'Uccellina sembrano testimoniare attività portuali di scambio. Nel 225 a.C. gli abitanti delle colline assistono nella piana sotto Talamone al tremendo scontro fra Galli e Romani conosciuto come "battaglia di Campo Regio". Nel 89 a.C. gli etruschi divengono cittadini romani e nell'87 Mario sbarca a Talamone per arruolare uomini contro Silla che una volta uscito vincitore si vendica distruggendo l'abitato e le sue campagne. Nel I sec. a.C. si sviluppano le Stationes, aree di sosta lungo l'Aurelia come Telamon nei pressi di Talamone di cui rimangono pochi resti e la Statio di Hasta, poco distante da Alberese, composta da un grande recinto con impianto termale all'interno. Nonostante la scarsità dei reperti si deduce, da testimonianze indirette, una forte presenza umana in epoca romana imperiale; i marmi dei pavimenti dell'Abbazia di S. Rabano, essendo recuperi romani, testimoniano l'esistenza, oltre allo statio di Hasta, di almeno una villa (forse la villa in località Piscina Statua) e di un altro abitato. -un cimitero è stato rinvenuto presso lo Scoglietto, mentre a Talamone, all'inizio degli itinerari, sono visibili i resti di cisterne e di strutture fortificate forse appartenenti ad una villa. Già alla fine del II sec. d.C., parallelamente al declino dell'-impero Romano, si manifestano i primi segnali del degrado ambientale che porterà nei secoli successivi all'impaludamento delle zone costiere. A testimonianza del progressivo cambiamento delle condizioni ambientali, gli scavi delle ville risalenti a questo periodo hanno restituito, oltre a resti di vegetazione palustre, anche scheletri, come nel caso della villa di Settefinestre presso Capalbio, palesemente affetti da anemia mediterranea, una malattia che si diffonde nelle popolazioni che vivono in zone malariche. Di questo momento di declino ci offre una descrizione minuziosa lo scrittore tardo antico Rutilio Namaziano (IV sec. d.C.) che nel corso del suo viaggio per mare verso la Gallia è costretto a passare una notte in una tenda di fortuna presso la foce del fiume Ombrone.
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